式细胞仪（Flow cytometer ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。

流式细胞术依赖于激光对单个细胞的检测以及对产生荧光和散射光的信号收集。流式细胞仪包含 3 个主要组件：液流系统、光学系统和电子系统。每个组件都扮演着不同的角色。

液流系统由细胞和鞘液流过的管和玻璃皿组成，对细胞流量和速度都要求高精度。光学系统由激发细胞的光源、检测细胞荧光和散射光的检测器、透镜和滤波器组成。每个装置必须具有高稳定性和灵敏度，以实现高       精度的细胞分析。电子系统接收来自光学系统的电信号输出，处理数据，并分析测量结果。

一，基本原理

当用荧光染料标记的细胞悬浮液倒入细管中时，细胞以一定的间隔移动通过细管。然后用激光光束照射这些细胞。从荧光物质发射出的荧光和由细胞散射的光由光电检测器检测和监测。

二，激光检测点

细胞与激光发生相互作用的地方，称为激光检测点 。在这里，细胞排成单列通过，而聚焦的激发光穿过细胞流。

流式细胞仪中常用激光器与荧光材料

在流式细胞仪中，最常见的激发光源为激光器。激光具有一致性 （具有同步、相同的波频率）、 单色性 （具有单一波长）和高能性，这些特点可确保照射到细胞的光是具有特定波长的均一光线。流式细胞仪通常配置一个或多个激光器， 下图列出了现有仪器的常见激发光源。

三，激光光源的位置设计

流式细胞仪的光源部分会用到多款激光器，多款激光器的位置设计一般有两种方式：并列式和混合式。

并列式是激光光源并列成一排或一列，细胞通过激光检测点时，一次暴露于一个激发光源。混合式是所有激光器共用同一条光路，细胞同时被多个激光器激发。并列式和混合式可以同时用于流式细胞仪设备中。

并列式的激光位置设计，由于细胞从一个激光器移动到继电器中的下一个激光器需要时间，因此，系统会存在一定的时间延迟。

在混合式设计中，两个激光器位于相同位置，两个激光器的光束同时激发细胞。两个激光器共用同一条光路，包括相同的发射滤光片和检测器。

虽然大多数仪器通常会自动设置时间延迟，但如果需要，也可以手动监控和调整。如果该时间延迟设置不正确，可能会观察到信号丢失，或者是来自两个不同细胞的重叠信号。

正确和错误延时设置的结果如下图所示。该实例中使用的荧光颗粒上具有等量的两种不同荧光染料，一种在488nm激发并发出绿色荧光，另一种在561nm激发并发出红色荧光。由于两种荧光染料表达在同一个颗粒上，所以预计它们的事件数相等，并且预计在时间延长设置适当的情况下，它们能够以相似的模式发射。

图中A展示了这类实验的数据。在图B中，数据刚开始看起来与图A相似，但是操作者在时间点30时调整了时间延迟设置，并在时间点50再次调整。请注意，下游激光器的荧光（即继电器中第二个激光器）比触发激光器（继电器中第一个激光器）的荧光更低，并且事件的扩散范围更广。

四，荧光染料的选择

针对不同激光光源的位置设计，选用的荧光染料必须有所不同。以并列式激光光源设计为例。假设有两种激光器，这两种激光器在不同时间激发同一个细胞，每种激光器具有独立的检测器。由于两种激光器激发同一个细胞存在时间差。因此，可以选择这样两种荧光染料与之对应：接收不同激光时，产生相同波长的荧光。

以流式细胞仪常用的两种激光器488nm和633nm为例。藻红蛋白-Alexa Fluor 647（PE-AF647）的激发波长为488nm，别藻蓝蛋白（APC）的激发波长为633nm，这两种荧光染料的发射波长都为680nm。

五，光路的引导

流式细胞仪中很重要的一个部分就是光路的引导。引导光路常用的器件为滤光片和分色镜。

1，滤光片

滤光片分为三种：长通（LP）滤光片，短通（SP）滤光片和带通（BP）滤光片。

长通（LP）滤光片允许特定波长以上的所有光通过。 图7A 的实例是LP 500滤光片，表示波长在500nm以上的所有光均可通过滤光片。请注意，紫外和紫色波长会偏转，而蓝色、绿色和黄色光线可以通过。

短通（SP）滤光片允许低于特定波长的所有光通过。 图7B 的实例是SP 500滤光片，表示只有波长低于500nm的光可以通过滤光片。紫外线、紫色和蓝色光可以通过，而波长较高的绿色和黄色光被偏转。

带通（BP）滤光片 可被认为是LP和SP滤光片的交叉组合。只有特定波长范围内的光可以通过滤光片。图7C 的实例是一个520/20 BP滤光片，表示只有波长在520nm±10nm内的光可以通过滤光片，或者说是只有波长在510-530 nm范围之间的光可以通过滤光片。其他所有光将被偏转。

2，分色镜

双色镜，也称为二色分光镜，是具有镜面涂层的LP和SP滤光片形式。除了可通过特定波长以上（LP）或特定波长以下（SP）的光之外，双色镜还可以将光反射到一定方向（如下图） 。

例如，500LP双色镜可传输波长在500nm 以上 的光并将波长在500nm以下的光反射到其他方向。525SP双色镜可传输波长在525 nm以下的所有光，并将波长在525nm以上的所有光反射到其他方向。

该实例中的双色镜（或分光镜）分别与特定检测器相连。第一个双色镜 (1) 可反射红光并将其引导至红色检测器，同时允许低于红色光波长的所有光通过并传输到光路中下一个双色镜。第二个双色镜 (2) 可反射黄光并将其引导至第二个检测器，同时允许蓝光和绿光通过。最后一个双色镜 ( 3 ) 反射绿光并将其引导至第三个检测器，并允许蓝光通过。

仪器中的滤光片、分色镜和检测器需要匹配至选择的荧光染料，这样才能得到准确的检测结果。

六，选择探测器

探测器捕获由激发态荧光染料和散射激光发射的光子，将它们转换成电信号，并传递到电子系统。流式细胞仪可使用多种类型的检测器，最常见的类型是光电二极管（PD）和光电倍增管（PMT）。传统上用于光纤通信的雪崩光电二极管（APD） 已开始被一些流式细胞仪使用，它特别适用于检测长波发射（> 650 nm）。也有一些仪器使用相机进行检测，但并不常见。

PD价格便宜，但是灵敏度较低，它们对光电流的放大能力不如PMT。PD通常用于负责处理最明亮的光或信号通道，如前向角散射光通道。

PMT对于低信号水平更敏感，包括SiMP（即硅光电倍增管MPPC），可以使单个光子的能量放大数百万倍。它们通常用于测量来自细胞的激发态荧光染料的荧光以及侧向角散射光信号。PMT的灵敏度也受到施加电压量的影响，需要根据具有指定配置的指定仪器上的PMT进行优化。滨松的PMT会配备高压电源模块，可以实现对电压和灵敏度的精准控制。

七，流式细胞仪的技术发展趋势---多色分析

1，什么是多色分析

为了获得迄今为止流式细胞术中尚未获得的更多信息，有必要用多种类型的标记物对细胞进行染色。在精确区分各种标记物组合的测量中，利用不同波长的激光器和探测器进行多色分析发挥着积极作用。

传统的荧光检测测量通常限于荧光强度高的波长范围。但是，测量和分析技术的最新进展让我们能够获得整个光谱的荧光信息。这提高了多色分析的精度，并将细胞分析的标准提高到更先进的水平。

2，多色分析面临的问题

在多色分析过程中，由于在测量中使用了多种荧光染料，不同波长的荧光可能在测量项目之间重叠，由于光泄漏到最初不用于测量的通道中而导致干扰。纠正这个问题的技术称为补偿。为了进行补偿，必须预测目标荧光染料之间的荧光重叠并将其从信号中去除。这种补偿处理的精度在很大程度上取决于流式细胞仪中探测器的灵敏度特性。

传统流式细胞术不能一次测量尽可能多的项目，但波长光谱之间的重叠较少，这使得测量更容易执行。如下图：

多色分析由于一次要测量的项目数量很大，这会导致测量光谱之间的重叠，因此多色分析需要复杂而精确的测量。如下图：

为了获得大量的精确数据，必须将检测波长范围扩展到近红外区域，这意味着探测器需要在近红外区域具有更高的灵敏度。为了满足这些需求，滨松正在努力提高其用于多色分析的探测器性能。

例如，与在光阴极面中使用碱性材料的传统光电倍增管相比，不断提高利用光阴极面中晶体材料的光电倍增管模块性能，并实现了更高的灵敏度和扩展的近红外灵敏度。提供一系列光电倍增管，在单个元件中具有多个检测通道，还提供易于使用的模块，其功能非常适合多色分析。

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