《自然光子学》最近的一项研究提出了一种新的多色荧光成像方法，该方法利用电化学荧光调制来可视化具有重叠发射光谱的多个细胞目标。

该技术利用电化学电位的变化来产生不同的荧光响应，从而增强了标准荧光显微镜的性能，无需进行硬件更改即可提高特异性和灵敏度。

荧光成像的进展

荧光显微镜在生物学中被广泛用于高细节度地研究细胞结构和活动。传统的多色成像依赖于具有独立发射光谱的荧光团，并且需要滤光片和分束器。这限制了可用的荧光团数量，需要谨慎选择。

虽然光谱分离和荧光寿命成像等方法有所帮助，但它们通常依赖于复杂的设备。我们仍然需要更简单、更灵活的方法来实现多色成像。

该方法如何运作

研究人员开发了一种在常规荧光显微镜中使用电化学荧光调制的实用方法。他们使用氧化铟锡（ITO）涂层的玻璃盖玻片，它既充当成像表面，又充当工作电极。

通过将ITO连接到恒电位仪，他们可以控制成像过程中的电化学电位。这使得他们能够调节不同染料的荧光强度，并为每种染料创建独特的电化学光谱（EC光谱）。

为了测试该方法，他们用 ATTO 655 和 STAR RED 等荧光团标记了微管和细胞核。通过扫描随时间变化的电化学电位，他们记录了延时图像，展现了每种染料独特的调制行为。

然后，他们利用非负约束的最小二乘拟合，从混合样本中分离出重叠信号。这使得仅使用单色光学装置就能准确识别每个荧光团。

该方法不仅适用于标准荧光成像，也适用于超分辨率受激发射损耗 (STED) 显微镜。他们在低氧缓冲液中使用氧化还原体系（半胱胺和铁氰化物），实现了有效的全细胞调控。这表明该方法无需改变现有显微镜硬件即可增强多色成像。

主要发现：扩大成像可能性

结果表明，电化学荧光调制技术能够可靠地分离来自多个荧光团的信号，即使它们的发射光谱重叠。利用 ATTO 655 和 STAR RED 等染料不同的电化学光谱，研究人员能够分离出来自重叠荧光团标记的细胞结构的信号。

他们利用最小二乘拟合法精确分离这些信号，在标准共聚焦显微镜上仅通过三个光谱通道实现了六色成像。分离过程始终将信号重叠（串扰）保持在最低水平。

该方法还能很好地分辨单个光谱通道内的四个荧光团，即使在标记严重的样品中也是如此。它与宽场显微镜和超分辨率STED显微镜兼容。在STED显微镜中，该团队仅使用一对激发和耗尽激光器就实现了高分辨率四色成像，同时保持了较低的光漂白和光谱干扰。

研究中的潜在用途

这项技术可应用于细胞生物学、神经科学和生物医学成像等众多领域。它提供了一种简单、经济高效且精度更高的多色成像方法。由于它可与现有显微镜配合使用，因此无需购买先进的光学元件或进行重大系统升级。

该方法能够对动态细胞过程和蛋白质相互作用进行详细成像，从而支持对复杂生物系统的研究。它还有望应用于高通量成像任务，并可用于诊断或治疗研究。

总的来说，它是一种扩展多色成像功能的实用工具，具有更高的精度和灵活性。